蛋白質分離純化步驟（二） 分離純化蛋白質的一般程序 2.1 材料的預處理及細胞破碎 分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有： 1. 機械破碎法 這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機，樣品前處理蛋白純化系統制造廠家、勻漿器、研缽等，樣品前處理蛋白純化系統制造廠家。 2. 滲透破碎法 這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎，樣品前處理蛋白純化系統制造廠家。 3. 反復凍融法 生物組織經凍結后，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜采用此法。 4. 超聲波法 使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破壞微生物細胞等。樣品前處理蛋白純化系統制造廠家

蛋白質分離純化步驟（二） 2.4 樣品的進一步分離純化 用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。 1. 凝膠過濾層析 凝膠過濾層析（gel-filtration chromatography）又稱為分子排阻層析或分子篩層析。它是將葡聚糖凝膠（Sephadex）裝入一個柱子中，制成凝膠柱。這種凝膠顆粒具有網狀結構，不同類型凝膠的網孔大小不同。當把蛋白質混合樣品加到凝膠柱中時，比凝膠網孔小的蛋白質可進入網孔內，而大于網孔的分子則不能進入被排阻在凝膠顆粒之外。當用洗脫液洗脫時，被排阻的分子量大的蛋白質直接通過凝膠之間的縫隙先被洗脫下來，而比網孔小的蛋白質可連續不斷地進入網孔內。這樣的小分子不但流經的路程長，而且受到來自凝膠內部的阻力也很大，所以蛋白質越小，從柱子上洗脫下來所需時間越長。由于不同蛋白質的分子大小不同，進入網孔的程度不同，因此流出的速度不同，洗脫所用體積及時間不同，從而達到分離的目的。江蘇專業蛋白純化系統

蛋白質分離純化步驟（二） 2.4.2 纖維素柱層析法 該法是利用蛋白質的酸堿性質作為分離的基礎。離子交換纖維素（cellulose ion-exchanger）是人工合成的纖維素衍生物，它具有松散的親水性網狀結構，有較大的表面積，使蛋白質大分子可以自由通過。因此常用于蛋白質的分離。 （1）羧甲基纖維素（CM-纖維素） 在纖維素顆粒上帶有羧甲基基團。在中性pH條件下，羧甲基上的質子可解離下來（圖2-27a），而溶液中帶正電荷的蛋白質分子可與纖維素顆粒上的羧甲基負電荷結合?？山粨Q的基團帶正電，因此是一種陽離子交換劑。蛋白質與離子交換纖維素之間結合能力的大小取決于彼此間相反電荷基團之間靜電吸引。 (2）二乙氨基乙基纖維素（DEAE-纖維素） 在中性pH條件下，它含有帶正電荷的基團，可與溶液中的帶負電荷的蛋白質結合，可交換的基團帶負電荷，因此是一種陰離子交換劑。當某一蛋白質混合溶液通過裝有DEAE-纖維素的層析柱時，帶正電荷的蛋白質不能結合而隨著洗脫液的流動先被洗脫下來。帶負電荷的蛋白質將被結合到柱上。結合力取決于彼此相反電荷基團間的靜電吸引。然后選用一定pH和離子強度的緩沖液進行洗脫，改變蛋白質分子所帶的靜電荷，依次從層析柱流出達到相互分離的目的。

蛋白質分離純化步驟 蛋白質分離純化的一般原則： 大多數蛋白質在組織細胞中都是和核酸等生物分子結合在一起，而且每種類型的細胞都含有成千上萬種不同的蛋白質。許多蛋白質在結構、性質上有許多相似之處，所以蛋白質的分離提純是一項復雜的工作。到目前為止，還沒有一**成的方法能把任何一種蛋白質從復雜的混合物中提取出來。但是對于任何一種蛋白質都有可能選擇一種較合適的分離純化程序以獲得高純度的制品。且分離的關鍵步驟、基本手段還是共同的。 蛋白質提純的目的是增加產品的純度和產量，同時又要保持和提高產品的生物活性。因此，要分離純化某一種蛋白質，首先應選擇一種含目的蛋白質較豐富的材料。其次，應設法避免蛋白質變性，以制備有活性的蛋白質。對于大多數蛋白質來說，純化操作都是在0～4℃的低溫下進行的。同時也應避免過酸、過堿的條件以及劇烈的攪拌和振蕩。另外，還要設法除去變性的蛋白質和其它雜蛋白，從而達到增加純度和提高產量的目的。

蛋白質分離純化步驟（二） 2.2 蛋白質的抽提 通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結構破壞，利于蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。 2.3蛋白質粗制品的獲得 選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法： 1. 等電點沉淀法 不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉淀法使它們相互分離。 2. 鹽析法 不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質仍保持其天然性質，并能再度溶解而不變性。 3. 有機溶劑沉淀法 中性有機溶劑如乙醇、**，它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉淀出來，因此可用來沉淀蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩定而析出。由于有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下操作.樣品前處理智能蛋白純化系統

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三、蛋白質分子量的測定 3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量 蛋白質在普通聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質分子大小、所帶電荷的量以及分子形狀。而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與此不同的是在樣品及電泳緩沖液中加入了十二烷基***鈉（sodium dodecylsulfate,SDS）。SDS是一種陰離子去污劑，可使蛋白質變性并解離成亞基。當蛋白質樣品中加入SDS（一般加入量為0.1％）后，SDS與蛋白質分子結合，使蛋白質分子帶上大量的負電荷，這些電荷量遠遠超過蛋白質分子原來所帶的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質之間的電荷差異。所有結合SDS的蛋白質-SDS復合物的形狀近似于長的橢園棒，它們的短軸是恒定的，而長軸與蛋白質分子量的大小成正比。這樣，消除了蛋白質之間原有的電荷和形狀的差異，電泳的速度只取決于蛋白質分子量的大小。 進行凝膠電泳時，常常用一種染料作前沿物質，蛋白質分子在電泳中的移動距離和前沿物質移動的距離之比值稱為相對遷移率，相對遷移率和分子質量的對數成直線關系。以標準蛋白質分子質量的對數和其相對遷移率作圖，得到標準曲線。將未知蛋白質在同樣條件下電泳，根據測得的樣品相對遷移率，從標準曲線上便可查出其分子量。樣品前處理蛋白純化系統制造廠家

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