蛋白質純化方法-親和層析親和層析法包括特異性配體親和層析法以及通用性配體親和層析法，浙江專業蛋白純化系統***的選擇。比較這兩種親和層析法。特異性配體親和層析法通常將復雜的生命大分子物質作為配體，它的結合力比較大河吸附選擇性比較強。而通用性配體親和層析法通常將簡單的小分子物質作為配體，因此，它具有低廉的成本，吸附容量比較高，浙江專業蛋白純化系統***的選擇，浙江專業蛋白純化系統***的選擇，通過對吸附和脫附條件的改善能夠使得層析的分辨率提高。原理親和層析的原理類似于酶-底物，***-受體與抗原-抗體等特異性反應的機理。有一定的親和力在每對反應物之間。與在酶與底物的反應中，只有特異的底物才可以結合一定的酶，使復合物產生相同。在親和層析中，只有特異的配體才可以和一定的生命大分子有親和力，并且使復合物產生。親和層析配體呈固相，而酶與底物的反應底物呈液相是它們的不同點。事實上，親和層析是在含有活化基團的基質M上以共價鍵的方式固化具有識別能力的配體L，將固相載體制作成功而固化后的配體束縛特異物質的能力依然保持。所以當在小層析柱裝入固相載體，使得欲分離的樣品在該柱經過。此時，樣品中對配體有親和力的物質S就能夠通過結構互補效應、范德瓦爾力與靜電引力等作用在固相載體上吸附著。 浙江專業蛋白純化系統***的選擇

蛋白質分離純化步驟（二） 2.4.3. 親和層析 親和層析（affinity-chromatography）分離技術是根據許多蛋白質對特定的化學基團具有專一性結合的原理。這些能被生物大分子如蛋白質所識別并與之結合的基團稱為配基或配體（ligand）。親和層析是一種極有效的分離純化蛋白質的方法。例如酶對它的底物具有特殊的親和力；抗原和抗體互為配基。以伴刀豆球蛋白A（concanavalin A）的分離純化為例，由于該蛋白對葡萄糖有專一性親和吸附，因此可把葡萄糖通過適當的化學反應共價地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面上。為了防止載體表面的空間位阻影響待分離的蛋白質大分子與其配基的結合，在配基和載體之間往往插入一段所謂的連接臂（或稱為間隔臂，spacerarm），使配體與載體之間保持足夠的距離。 將這種多糖顆粒裝入一定規格的玻璃管中就制成了一根親和層析柱。當含有伴刀豆球蛋白的提取液加到層析柱的上部，并沿柱從上往下過時，待純化的蛋白質與其特異性配基結合而被吸附到柱上，其他蛋白因不能與葡萄糖配基結合將通過柱子而流出（圖2-28a）。然后采用一定的洗脫條件，如濃的葡萄糖溶液進行洗脫，即可把該蛋白質洗脫下來，達到與其它蛋白質分離的目的。浙江專業蛋白純化系統***的選擇

實驗室及中試放大規模蛋白純化系統 Unique Autopure系列蛋白純化系統 主要應用領域 ： – 蛋白純化系統主要應用于單抗、重組蛋白、疫苗、生化 藥、、天然產物和多糖等生物制藥領域。用于生物制品的下游工藝的分離純化。 Unique AutoPure 系列蛋白純化系統 ： 產品特點及優勢： – 模塊化設計，提供多個配置，滿足特殊工藝流程需求 - 低脈動高精度雙柱塞輸液泵 ，保證優異的分離重現性 ; – 全系統與液體接觸的地方均由生物兼容性材料組成、符合FDA、USP VI等相關法規要求 ; – DAD全譜直讀檢測器，避免了傳統的機械切換式檢測器所帶來的不穩定性及高故障率 ; – 固定波長檢測器燈為長壽命LED燈，壽命大于8000小時，降低維護成本 ; – **技術紫外檢測器流通池，低死體積、低峰拓展，提高了色譜分離度 ; – 高靈敏度在線pH、電導率、紫外檢測器，低死體積、低峰拓展，提高了色譜分離度 ; – 集中了buffer選擇閥，自動進樣閥、柱位閥等自動化組件，提高了純化的自動化程度 ; – 具有柱前、柱后、壓差報警，氣泡傳感器檢測等功能，極大的保護了系統及層析柱的安全性 ; – 層析工作站軟件是一款功能強大、性能先進、高穩定性的色譜數據管理系

蛋白質分離純化步驟（二） 分離純化蛋白質的一般程序 2.1 材料的預處理及細胞破碎 分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有： 1. 機械破碎法 這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。 2. 滲透破碎法 這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。 3. 反復凍融法 生物組織經凍結后，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜采用此法。 4. 超聲波法 使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破壞微生物細胞等。

三、蛋白質分子量的測定 蛋白質分子量測定的方法很多，目前常用的方法有以下幾種。 3.1 凝膠過濾法 凝膠過濾法測定蛋白質分子量的原理如“分離純化方法”中所 述。一定型號的凝膠顆粒上具有一定大小的孔隙，只允許較小的分子進入膠粒，而大于孔隙的分子則不能進入膠粒而被排阻在膠粒外面。用洗脫液洗脫時，被排阻的分子量大的蛋白質先被洗脫下來，隨后能夠進入顆粒的蛋白質也按分子量大小而先后被洗脫下來，分子量越小的越后被洗脫下來。由于不同排阻范圍的葡聚糖凝膠有一特定的蛋白質分子量范圍，在此范圍內，分子量的對數和洗脫體積之間成線性關系。因此，用幾種已知分子量的蛋白質為標準進行層析分析，以每種蛋白質的洗脫體積對它們的分子量的對數作圖，繪制出標準洗脫曲線。未知蛋白質在同樣的條件下進行層析分析，根據其所用的洗脫體積，從標準洗脫曲線上可求出此未知蛋白質對應的分子量來。浙江專業蛋白純化系統***的選擇

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三、蛋白質分子量的測定 3.3 沉降法 沉降法又稱超速離心法。蛋白質溶液在受到強大的離心力作用時，蛋白質分子趨于下沉，沉降速度與蛋白質分子的大小、密度和分子形狀有關，也與溶劑的密度和粘度有關。蛋白質顆粒在離心場中的沉降速度用每單位時間內顆粒下沉的距離來表示。 在離心場中，蛋白質分子所受到的凈離心力（離心力減去浮力）與溶劑的摩擦力平衡時，每單位離心場強度的沉降速度稱為沉降系數（Sedimentation Coefficient）。國際上采用Svedberg單位作為沉降系數的單位，用S表示，以紀念超速離心法的創始人，瑞典***的蛋白質化學家T.Svedberg。一個Svedberg單位（或直接稱一個S）為1×10—13s。蛋白質的沉降系數大約在1×10—13～200×10—13s范圍內，即1S～200S。浙江專業蛋白純化系統***的選擇

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